实验3 广州大学城各校区空气微生物的多样性鉴定

一、目的要求

1. 掌握平板菌落成像技术革兰氏染色的方法。

2. 熟练应用革兰氏染色的方法进一步分型鉴定空气微生物。

3. 结合实验2的计数结果，综合评价广州大学城各校区空气微生态安全性。

二、基本原理

1. 平板与菌落成像

采用Tanon凝胶成像系统，选择白（黑）板和白光，调节焦距可以对平板进行整体成像，也可对菌落进行放大成像。

2. 革兰氏染色法

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、器材

Tanon凝胶成像系统；实验二培养的总菌平板和真菌平板；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤 （1）平板与菌落成像

采用Tanon凝胶成像系统，选择白（黑）板和白光，调节焦距可以对平板进行整体成像，也可对菌落进行放大成像，放大倍数根据菌落清晰度和形态可判定性确定。

（2） 革兰氏染色法

1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。

3. 固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 染色

（1）简单染色法：

① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。

② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。

③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法：

① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

④ 复染 用番红液染1～2min，水洗。

⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

(3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、结果与分析

（1）平板成像结果

（2）菌落成像结果与形态聚类（参考附件1）

（3）革兰氏染色与相似染结果聚类（参考附件2）

六、讨论

（1） 广州大学城各校区空气微生物的多样性与空气微生态安全性评价

环境中存在丰富的微生物，包括细菌和真菌，考察样品中存在的微生物种类和数量较多，各类菌中存在相互作用，如促进、拮抗等。由于取菌的地方气候温和，条件适宜，所以菌的种类属于平常易见的类型，如葡萄球菌、微球菌等。

样品中主要以葡萄球菌（Staphylococcus）为主，是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。多数为非致病菌，少数可导致疾病。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是医院交叉感染的重要来源，菌体直径约0.8μm，小球形，但在液体培养基的幼期培养中，常常分散，细菌细胞单独存在。空气中如果金黄色葡萄球菌含量过高会引起家禽的一种急性或慢性传染病，所以控制空气的质量对人类的健康来说至关重要。

（2）空气微生物鉴定方法可行性与有效性

1.采样点的选择很大程度上影响实验结果，应该设定体育馆周围采样区域，各点每天

分别选在8：00、11：00、15：00、20：00、22：00进行，连续2-3天，按照“田”字形进行样品的采集，菌落数取平均值。

2.实验仪器、实验试剂的选择要恰当，实验前预测菌落的类型，选择适合的染色方法。

3.环境因素测定，如采样点附近的空气流通情况、人流量、光照情况、降雨量等会影响到群落类型和数量的因素。

4.按平均值绘制日变化曲线，以及对曲线进行分析。

5.设计实验对照组。

按以上方法进行实验，方能提高实验的效率和效果。

七、作业

（1）结合两次野外采样，谈谈生态学课外实践的重要性和注意事项，以及你觉得还应该开展哪些生态学野外实验。

（2）查阅资料，了解空气微生物分型鉴定的其它方法和进展。

附1 自来水中代表性微生物的菌落形态特征

Supplement1 Representative colony-morphologic properties of isolated bacteria from tap

water 菌落号

菌落形态特征

菌落黑白扫描

测序样品号

1 2 3 4 7 10 12 13 15 16 18

边缘不规则，湿润半透明，中等大小

边整，中皱，不光滑，不透明，白色

边缘不规则，不光滑，不透明，白色

边整，光滑，湿润半透明，灰白色

边整，光滑，不透明，黄色

边整，光滑，湿润不透明，浅黄

边整，光滑，湿润半透明，浅黄

边整，光滑，不透明，灰白色

边整，光滑，湿润半透明、灰白色

边整，光滑，灰白色

边缘不规则，中皱，不光滑，白色

Y1 Y2 Y3 Y4 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11 Y13

通过平板分离，发现自来水中微生物的菌落，具有丰富的形态特征。这也指示了自来水中的微生物的多样性（表7）。为进一步鉴定这些微生物的种属特征，本论文拟通过16 S rDNA分析技术对这些代表性的菌落进行分子鉴定。

附2细菌类型鉴定

采用革兰氏染色法对细菌进行染色，染色表明空气中细菌以G(+)球菌为主（葡萄球菌、微球菌)，其次为G(+)芽孢杆菌、棒状杆菌，极少发现G(-)。G(-)主要为大肠杆菌。大肠杆菌为兼性厌氧型微生物，一般生存于肠道中等厌氧的环境中，因此，在厌氧的环境下跟适合其生长，在空气中比较少存在。

G (+)球菌 G (+)微球菌 G (+)杆菌