一.试验目标
进修SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的道理和根本操纵技巧. 二.试验道理
蛋白质是两性电解质,在必定的pH前提下解离而带电荷.当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的若干.蛋白质颗粒的大小和分子外形.电场强度等.
聚丙烯酰胺凝胶是由必定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔构造.本实—6.8,基层胶pH＝8.9;Tris—HCI缓冲液中的Tris用于保持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子;CI是前导离子.在pH6.8时,缓冲液中的Gly为尾随离子,而在pH＝8.9时,Gly的解离度增长;如许浓缩胶和分别胶之间pH的不持续性,控制了慢离子的解离度,进而达到控制其有用迁徙率之目标.不合蛋白质具有不合的等电点,在进入分别胶后,各类蛋白质因为所带的静电荷不合,而有不合的迁徙率.因为在聚丙烯酰胺凝胶电泳中消失的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不合的蛋白质在统一电场中达到有用的分别.
假如在聚丙烯酰胺凝胶中参加必定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),因为SDS带有大量的负电荷,且这种阴离子概况活性剂能使蛋白质变性,特殊是在强还原剂如巯基乙醇存鄙人,蛋白质分子内的二硫键被还原,肽链完整伸展,使蛋白质分子与SDS充分联合,形成带负电性的蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超出蛋白质分子原有的电荷量,掩饰了不合蛋白质间所带电荷上的差别.蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢.蛋白质的分子量与电泳迁徙率之间的关系
--
是：
Mr=K(10
logK——截距; b——斜率;
Rm——相对迁徙率.
试验证实,蛋白质分子量在15,000—200,000的规模内,电泳迁徙率与分子量的对数之间呈线性关系.蛋白质的相对迁徙率Rm＝蛋白质样品的迁徙距离／染料(溴酚蓝)迁徙距离.如许,在统一电场中进行电泳,把尺度蛋白质的相对迁徙率与响应的蛋白质分子量对数作图,由未知蛋白的相对迁徙率可从尺度曲线上求出它的分子量.
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有轻便.快速.重
复性好的长处,是今朝一般试验室经常应用的测定蛋白质分子量的办法.
三.试剂及重要器材 1．重要试剂 1)尺度蛋白混杂液
内含：兔磷酸化酶B(Mw 97,400),牛血清蛋白(Mw 66,200),兔肌动蛋白(Mw 43,000),牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和鸡蛋清溶菌酶(Mw 14,400)
2)30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g,亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 0.8g,加双蒸水至100mL.外包锡纸,4℃冰箱保管,30天内应用.
3)分别胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加双蒸水消融,6mol/L HCl调pH8.8,定容100mL.4℃冰箱保管
4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水消融,6mol/L HCl调pH6.8,并定容到100mL.4℃冰箱保管
-b·m
) logMr=LogK—b·Rm,
式中 Mr——蛋白质的分子量;
5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg,Tris 3g,Gly 14.4g,加双蒸水消融并定容到1000mL.4℃冰箱保管. 6)10％SDS,室温保管
7)质量浓度10％过硫酸铵(新颖配制)
8)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL,甘油2mL,10％SDS 2mL,β-巯基乙醇1mL,0.1％溴酚蓝0.5mL,加蒸馏水定溶至10mL.
9)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250,参加91ml50%甲醇,9ml冰醋酸
10)脱色液：50ml甲醇,75ml冰醋酸与875ml双蒸水混杂 11)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL ) 2．试验器材
1) 2) 3) 4)
DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 电泳仪
长滴管及微量加样器
烧杯(250mL.500m1).量筒(500mL. 250m1).造就皿
l5cm) 打针器等
(15cm
5)
四.试验操纵
1． 装板
将密封用硅胶框放在平玻璃上,然后将凹型玻璃与平玻璃重叠,将两块玻璃立起来使底端接触桌面,用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内,然后拔出斜插板到适中程度, 即可灌胶.
2． 凝胶的聚合
分别胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的次序及比例,设置装备摆设10％的分别胶和4.8％的浓缩胶.
试剂名称 Acr/Bis 30%/ml 分别胶缓冲液（pH8.9）/ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS/ml 10%的分别胶 0 5%的浓缩胶 0 10%过硫酸铵/ul 双蒸水/ml TEMED/ul 50 5 25 5 按上表各液参加混匀后配制成分别胶后,将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面徐徐用滴管滴入,当心不要产朝气泡.将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL.然后用细滴管或打针器细心注入少量水,约0.5-1mL.室温放置聚合30-40min.
待分别胶聚合后,用滤纸条轻轻吸去分别胶概况的水分,按上表制备浓缩胶.用长滴管当心加到分别胶的上面,拔出样品模型(梳子);待浓缩胶聚合后,当心拔出样品模型. 3．蛋白质样品的处理
若尺度蛋白质或欲分别的蛋白质样品是固体,称取lmg的样品消融于lmL 0.5mol／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中;若样品是液体,要测定蛋白质浓度,按1.0～1.5mg／mL溶液比例,取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀.本试验所用样品为15～20—20
g的尺度蛋白样品溶液,放置在0.5mL的离心管中,参加15l的样品处理液.在100℃水浴中处理2min,冷却至室温
l,按照尺度蛋白的处理办
后备用.
汲取未知分子量的蛋白质样品20法进行处理.
4． 加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样办法
用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去失落密封用硅胶框,留意在上述进程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,拔出斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,留意防止在电泳槽内消失气泡.
加样时可用加样器斜靠在提手边沿的凹槽内,以准肯定位加样地位,或用微量打针器依次在各样品槽内加样,各加10～15
l(含蛋白质10～15
g),稀溶液可加20～30
l (还要依
据胶的厚度灵巧控制). 5．电泳
加样完毕,盖好上盖,衔接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电流控制在15～20mA,大约15～20min;样品中的溴酚蓝指导剂到达分别胶之后,电流升到30～45mA,电泳进程保持电流稳固.当溴酚蓝指导剂迁徙到距前沿1～2cm处即停滞电泳,约1-2小时.如室温高,打开电泳槽轮回水,下降电泳温度. 6．染色.脱色
电泳停滞后,关失落电源,掏出玻璃板,在长短两块玻璃板下角闲暇内,用刀轻轻撬动,即将胶面与一块玻璃板离开,然后轻轻将胶片托起,指导剂区带中间拔出铜丝作为标记,放入大造就皿中染色,应用0.25％的考马斯亮蓝染液,染色2～4h,须要时可留宿.
弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几回,然后参加脱色液,进行集中脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清楚为止. 7．成果处理
1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中间到加样孔的距离),测量指导染料迁徙的距离. 2)按以下公式盘算蛋白质样品的相对迁徙率(Rm)
相对迁徙率＝样品迁徙距离(cm)／染料迁徙距离(cm)
3)尺度曲线的制造：以各尺度蛋白质相对迁徙率为横坐标,蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图,得到一条尺度曲线.
4)测定蛋白质样品的分子量：依据待测蛋白质样品的相对迁徙率,从尺度曲线上查得该蛋白质的分子量. 五.思虑题
1． 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不持续性是什么？ 2． 电泳时的三个物理效应是什么？是如何造成的？ 3． 电泳后高低槽缓冲液能否混杂后再应用？为什么？ 4． 上样缓冲液中参加甘油的感化是什么？
5． 贮液配制及贮存应留意什么？
6．过硫酸铵.7%乙酸和考马斯亮蓝在试验中有什么感化？
附：不合分别胶的配制办法
分别胶的浓度 双蒸水/ml 1.5mol/L Tris-Hcl(pH8.8)/ml 10%SDS/ml 凝胶储备液（Acr/Bis）/ml 10%过硫酸铵/ul TEMED/ul 总体积/ml
20% 50 5 10
15% 50 5 10
12% 50 5 10
10% 50 5 10
7.5% 50 5 10
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