皮脂分泌物中人体蠕形螨分离方法的改进

转载自中国科技信息网

蠕形螨(demodex)是一类小型永久性寄生虫，寄生于人和哺乳动物的毛囊和皮脂腺内，已知有140余种和亚种，寄生于人体的蠕形螨有毛囊蠕形螨（demodex folliculorum）和皮脂腺蠕形螨（demodex brevis）两种。人体蠕形螨呈世界性分布，报道的感染率国外为27%～100%，国内为0.8%～81%[1]。人群普遍易感，以颜面、鼻、额、眼睑和外耳道的部位寄生密度为高。人体蠕形螨以细胞液等为营养物质，其强壮的螯肢对宿主的皮肤组织有不同程度的损害，引起毛囊扩张，上皮变性。轻者出现皮肤瘙痒、小丘疹等，重者导致酒渣鼻、毛囊炎、脂溢性皮炎和痤疮。临床调查结果显示,毛囊蠕形螨感染率明显高于皮脂腺蠕形螨感染率, 蠕形螨感染率湿润型皮肤高于干燥型皮肤，面部罹患各种皮肤病的蠕形螨检出率为92.55%[2]。 对蠕形螨的研究常需要单个虫体样本以供实验，但一直以来人体蠕形螨的分离及人工培养十分困难，而且虫体微小透明（大小仅100～400μm），比重轻，且脆弱，体表常附着有厚重皮脂、皮肤碎屑、污垢等杂质，不易分离，经过反复试验，摸索和总结出一些使样本处理更加快捷、精准的方法，顺利从受检者的皮脂分泌物中快速、完整的分离出清洁的活螨。现将方法介绍如下。 1材料和方法 1.1 实验材料

1.1.1 自制刮取式取螨器 选用长约20cm,直径约0.4cm的实心不锈钢条,将一端压制成2～5 cm长，0.2cm厚的薄片,呈弧形向内略卷曲，形似汤勺或船浆状，将四周打磨光滑 ,操作时不会损伤皮肤，安全、耐用且轻巧。按取材部位选用大小号，在取材面积较大的颈、背部选用大号取螨器，在鼻翼、口周皮肤等取材面积较窄处选用小号取螨器(图1)。该取螨器的优点在于可一次将患处挤出的皮脂刮取干净，同时因不锈钢可耐高温，操作者在使用后即将取螨器刮片端用酒精灯烧灼灭菌，防止取螨器接触下一受试者而导致细菌或蠕形螨的交叉感染。

1.1.2 改良昆虫针 其针杆细长有弹性，易于操作，针尖圆钝，不易损伤虫体,为目前挑取蠕形螨的首选工具。 1.2 方法

1.2.1标本收集时间和对象 蠕形螨感染存在季节消长，夏季感染率偏高， 是人体蠕形螨标本采集的最佳时机。感染度标准参照每1cm2皮肤计算螨的数量，分为轻中重3度： 1～5只为轻度感染(+)，6～10只为中度感染(++)，10只以上为重度感染(+++)[3]。 选取阳性中、重度感染的成年受检者60名，男女为2:1，年龄14～30岁，用温水清洁面部后用毛巾热敷2min，使受检者皮温升高，毛孔舒张、通畅。

1.2.2 操作方法 选取患者皮脂分泌丰富部位采用挤压涂片法取螨。依据取螨部位不同，方法各异。①鼻部检螨。患者于医师对面坐下，头靠背椅大约呈60°，仰头不动，医师带上指套，拇指与食指相距约1cm，用指内侧共同合力快速挤压患者鼻沟，鼻翼部，挤出线头状乳白色皮脂，用取螨器刮取即可[4]；②额部检螨。嘱患者眼向下看，医师用左手拇指将患者额部皮肤向上推，右手持取螨器钝端向内下刮挤出皮脂 ；③其他部位检螨。绷紧该处皮肤，加压后挤出皮脂用取螨器刮取。将取螨器上的皮脂均匀涂抹在载玻片中央，然后立即将取螨器刮片端用酒精灯烧灼灭菌后冷却备用。滴加1～2滴2%（安利）餐具洗洁精在载玻片中央的皮脂上[5]，在40倍解剖镜直视下用改良昆虫针将两者充分搅拌混匀，碾碎大块皮脂，展开拉网式寻查，挑取方法1：初学者可以在玻片边缘滴加一滴2%（安利）餐具洗洁精，用针尖轻轻将单个虫体随液体移至玻片边缘，再从玻片侧缘挑起虫体。方法2：将改良昆虫针垂直伸入螨体下方，迅速上挑，使螨附着于针尖上[5] 。对在解剖镜下分不清虫体

类别的蠕形螨，可重置于普通光学显微镜高倍镜下仔细识别分类后进行分离。蠕形螨活动力随温度上升而增强[4]，需要确定虫体存活状态时，适当升高室温，高倍镜下可观察到活螨四肢和头部口器有明显摆动感，卵、幼虫、若虫、死虫是触之不动的。然后将活虫体分类逐个挑至备有双蒸水的凹玻片中，将针尖浸入水中轻涮几下，再回到解剖镜下观察针尖有无虫体附着，确定虫体是否挑入，反复用双蒸水轻柔清洗2次，将虫体附着的皮脂污物彻底去除干净，获得清洁的活蠕形螨。

挤压涂片法取脂时患者可能感到不适，有重压感或者疼痛感，绷紧该处皮肤，可减轻牵刮刺激[6]。蠕形螨的活动力受环境温度影响较大，2005年赵亚娥. 郭娜的离体实验表明,毛囊蠕形螨耐低温而不耐高温;存活适温在8℃～30℃之间[7]，故整个操作过程将室温控制在28℃～30℃。刮取的含螨皮脂混合物如不能马上处理，连同取螨器一同放在湿冷环境(4℃冰箱)短时储存[5]。操作要准确娴熟，标本的采集和处理过程控制在20min内完成，防止虫体因短期离开人体而发生皱缩变形，使拍摄图片不准确，出现结构假象而影响对观察结果的判断。

2 结果

在1个月反复实验中,从57位中、重度感染患者鼻部、额部、背部皮脂分泌物中共分离出了301条清洁的毛囊蠕形螨和47条皮脂蠕形螨。随着熟练程度的提高,每次从患者体表皮肤中分离出清洁蠕形螨的整个操作时间控制在约3～5min/部位。 3 讨论

采用上述人体蠕形螨样本分离方法，从受检者皮脂分泌物中快速分离出完整单个清洁活螨。①在取螨方法的选择上，透明胶纸取螨法经过一夜的粘贴，虫体都已死亡或变形，取得活螨数量较少。另外，少数过敏体质者会导致皮肤过敏，因此没有选用此法[8]。挤压涂片法取出的蠕形螨是活螨，标本数量多且新鲜度好。该法检螨比透明胶纸法快速准确而且方便，其结果可作科研计数；②在取螨工具选择上，自制刮取式取螨器制作简单、经济、方便耐用，使用安全轻巧，易于操作，也适用于门诊各类真菌感染患者需刮取皮屑做快速诊断的检查。挑螨工具曾尝试使用皮试针头，其优点是手持轻巧，针尖细直，便于观察，操作时针头光滑不易附着皮脂。缺点是质地过于坚硬，边缘尖锐，易损伤标本，挑取标本时虫体易从针尖滑落，反复对比试验后确定改良昆虫针为目前最理想的挑螨工具；③选用凹玻片作为清洗容器，一方面是避免在操作时清洗液外溢而丢失标本，另一方面是让操作对象集中在视野中，便于寻找虫体也可防止清洗液快速挥发而变干燥，这些优点是普通玻片所不具有的；④在皮脂溶解剂的选择上，曾选用过液体石蜡、甘油、植物油等，效果均不理想。2007年刘莹、李速婷等提出石蜡虽能较好溶解虫体体表皮脂，但在样品表面形成较厚的油层，形成绝缘层，无法进行电镜观察，甘油清除皮脂效果不够彻底，认为2% 洗洁精是溶解虫体体表皮脂的最佳选择[8]。同年，赵岩，郭淑玲等指出用2%的餐洗净溶液洗涤螨虫体表油污效果最好，残留在螨体上的餐洗净水溶性好，易被蒸馏水洗去。4℃ 时，蠕形螨在2%餐洗净溶液中可存活3 h以上，为蠕形螨分离清洗提供了充足的时间[5]。10%KOH溶脂效果非常好，解剖镜下可使混悬液立即变清澈，虫体暴露尤为清晰，但是考虑到氢氧化钾属强碱，用于临床快速诊断很好，用于实验研究却对虫体损伤作用大，虫体形态可能会发生较大改变，而2%（安利）餐具洗洁精属弱碱性，质优于其他市面洗涤产品，作用温和且去脂效果佳，同时对虫体生物学特性影响相对较小，最终选用市售2% （安利）餐具洗洁精作为皮脂溶解剂。