赵自云 ，李莉 ， 牟晓峰 青岛大学医学院第二附属医院 检验科
摘要：目的 比较临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）诱导型克林霉素耐药的发生率，评价全自动细菌检测仪检测诱导型克林霉素耐药的临床应用价值。 方法 对临床分离得到的金黄色葡萄球菌进行耐甲氧西林检测，然后用VITEK 2微生物分析系统和双纸片扩散法检测其诱导性，并比较检测结果。 结果 291例金黄色葡萄球菌，MRSA占45.02％(131／291)，MSSA占54.98％ (160／291)，红霉素和克林霉素同时耐药的比例分别为58.02%、46.05%，红霉素和克林霉素同时敏感的比例分别为为21.88％、24.43％，erm基因介导诱导型耐药的比例分别为为12.98％、38.75％，泵出型耐药比例分别为为4.57%、3.12％。MRSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为73.91%，而MSSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为77.27%。纸片法和梅里埃VITEK2两种方法检测诱导酶的比较无差别。 结论： VITEK2和双纸片法两种方法检测能力无差别，均可在临床使用。金黄色葡萄球菌红霉素诱导克林霉素耐药问题严重，临床微生物实验室应常规进行诱导试验以保证克林霉素耐药检出的准确性，帮助临床合理有效及时的使用正确的抗菌药物。
关键词：MRSA，MSSA，红霉素，克林霉素，诱导耐药
Comparative Study of Inducible Resistance to Erythromycin and Clindamycin
of MRSA and MSSA
Zhao Ziyun ， Li Li， Mu Xiaofeng
Department of Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College
Abstract：Objective To investigate the prevalence of inducible clindamycin resistance in clinical isolates of MRSA and MSSA, and the VITEK 2 was compared with D-test in detecting the inducible clindamycin resistance in S.aureus． Method Bacteria identification and susceptibility testing were performed by VITEK-2 system ．The inducible Clindamycin resistance was determined by VITEK-2 system conpaired with D test. Results In 291 cases
of Staphylococcus aureus, MRSA accounted for 45.02% (131/291) of MSSA accounted for 54.98% (160/291), both erythromycin and Clindamycin resistant rates were 58.02%, 46.05%,both erythromycin and Clindamycin sensitive respectively 21.88%, 24.43% of erm gene mediated inducible resistance rates were 12.98%, 38.75%, the pump resistance rates were 4.57%, 3.12%. MRSA resistant to erythromycin Clindamycin-sensitive strains, the induction rate was 73.91%, while MSSA erythromycin resistance in clindamycin sensitive strains, the induction rate of 77.27%. No significant difference between the disk diffusion method and the VITEK2 to detect inducible enzyme. Conclusion Both D test and microdilution methods can be used to detect the inducible clindamycin resistance in S．aureus．The inducible clindamyein resistance must be detected in clinical microbiology laboratory for reasonable use of antimicrobial agents.
Key Words：MRSA ，MSSA ， Erythromycin ， Clindamycin，Induced Resistance
金黄色葡萄球菌是医院感染重要的致病菌，可引起外科切口、创伤等局部化脓性感染和骨髓炎、肺炎、心内膜炎等全身感染，被认为是致命的感染性疾病。近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)比例的上升，使金黄色葡萄球菌对许多抗菌药物耐药。临床用于MRSA感染的首选药物为糖肽类抗菌药物，大环内酯类、林可酰胺类亦广泛用于临床治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，尤其是克林霉素，由于其组织渗透性强等特点常被作为对青霉素过敏或MRSA的首选替代药物。随着抗生索的广泛使用和不合理应用，克林霉素耐药菌株逐渐增加．且研究发现克林霉素耐药具有结构型和诱导型两种耐药表型，红霉素耐药有诱导克林霉索耐药的作用[1-2]。。针对这种现象，2004年美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLs/CLSI)提倡每个实验室都应根据双纸片法(即D试验)检测葡萄球菌的诱导克林霉素耐药试验来报告克林霉素敏感性结果，并制定了相应的标准操作规程[3] 。而稀释法检测诱导试验一直都有争议[4]。为探讨双纸片法和梅里埃VITEK2两种方法对对临床分离金黄色葡萄球菌进行诱导型克林霉素耐药检测，并对MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）诱导情况进行比较，现报道如下。
1 材料与方法 1.1 菌株来源
均来青岛市中心医疗集团所属中心医院、肿瘤医院、职业病医院，以及四方、李沧区等社区医院2011年1月1日－2011年12月31日的临床标本。按《全国临床检验操作规程》(第3版)进行接种和培养。去除同一病人同一部位分离的重复菌株。
1.2 细菌鉴定和药敏试验：
参照《全国临床检验操作规程》(第3版)，经革兰染色、触酶试验、凝聚因子试验、葡萄球菌凝固酶试验测定、触酶试验、凝聚因子试验或葡萄球菌凝固酶试验阳性。所有菌株均用法国梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定；药敏实验为MIC法；鉴定和药敏试剂盒购自法国梅里埃公司；普通血平板、巧克力平板、M-H琼脂平板购自济南百博生物科技有限公司。头孢西丁(30ug)、红霉素(15ug)和克林霉素(2ug)药敏纸片均系英国Oxoid公司产品；质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923购自卫生部临床检验中心。 1.3 MRSA 检测
以全自动细菌鉴定仪头孢西丁筛选，筛选阳性者，配制0.5麦氏浊度金黄色葡萄球菌悬浊液，均匀涂布在M-H平板上，贴头孢西丁和苯唑西林双纸片复检。按CLSI 2011年版标准判断结果，头孢西丁抑菌环直径<19mm,苯唑西林抑菌环直径<11mm者为耐甲氧西林检测阳性。 1.4 克林霉素诱导实验
双纸片法和梅里埃VITEK2两种方法对对临床分离金黄色葡萄球菌进行诱导型克林霉素耐药检测。 1.4.1双纸片法
根据《全国临床检验操作规程》(第3版)， 配制0.5麦氏浊度金黄色葡萄球菌悬浊液，均匀涂布在M-H平板上，然后贴上红霉素纸片(15ug)和克林霉素纸片(2ug)，两纸片中心相距15mm ，放35℃孵育24 h，观察在靠近红霉素纸片一侧的克林霉素抑菌环有无截平现象，即D型环形成，有D型环者为诱导型克林霉素耐药试验阳性，无D型环者为阴性。
1.4.2梅里埃VITEK2
配制0.5麦氏浊度金黄色葡萄球菌悬浊液，用梅里埃AST-GP67药敏检测板按照操作规程进行药敏试验，仪器专家系统自动进行克林霉素诱导实验。 1.5 结果判断和数据分析
按CLSI 2011年版判断药敏试验结果，采用卡方检验统计分析数据 2 结果：
2.1 MRSA临床分离率
2011年各类标本共分离出金黄色葡萄球291株，其中MRSA共131株，占45.02%
[5]
（131/291），与2009年的25.83％（31/120）比较，MRSA的比例有较大幅度增长（经
χ2检验，χ2=13.09，P<0.01,有显著性差异）。
2.2 双纸片法和梅里埃VITEK2两种方法检测诱导酶的比较
双纸片法检测到78株诱导酶阳性金黄色葡萄球，而双纸片法检测到79株诱导酶阳性金黄色葡萄球，两种方法检测能力无差别（经χ2检验， P>0.05,无显著性差异）见表1。以D试验为“金标准”， VITEK2检测克林霉素诱导酶的敏感性=98.73%、特异性=100%、准确性=99.66%、阳性预测值=100%、阴性预测值=99.53%。
表1两种方法检测诱导酶的比较
双纸片法
VITEK2 阳性 阴性 阳性 78 0 阴性 1 212
2.3 MRSA与MSSA克林霉素诱导耐药发生率的比较
131株MRSA中D试验阳性17株，诱导耐药发生率为12.98％ ；160株MSSA 中D试验阳性62株，诱导耐药发生率为38.75％，经χ2检验，χ2=24.19，P<0.01,有极显著性差异，MSSA诱导耐药发生率高于MRSA，见表2。MRSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为73.91%，MSSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为77.27%， 2.4 耐药表型
131株MRSA中，红霉素和克林霉素均敏感的32株，红霉素和克林霉素均耐药的68株，红霉素耐药而克林霉素敏感的14株，红霉素耐药而克林霉素诱导耐药的17株。160株MSSA对红霉素和克林霉素均敏感的30株，对红霉素和克林霉素均耐药的51株，
红霉素耐药而克林霉素敏感的17株，对红霉素耐药而克林霉素诱导耐药的62株。没有检测出红霉素敏感而克林霉素耐药的菌株。见表2。
表2 金黄色葡萄球菌红霉素和克林霉素耐药表型
甲氧西林检测类型
株数 E-S/C-S(%) E-R/C-R(%) E-R/C-I(%) E-R/C-S(%) 131 160 291
32（24.43） 76（58.02） 17（12.98） 6（4.57） 35（21.88） 58（46.05） 62（38.75） 5（3.12） 67（23.02） 134（40.89） 79（27.15） 11（3.74）
MRSA MSSA 合计
E:红霉素 C：克林霉素 S：敏感 R:耐药 I:诱导耐药
3.讨论
金黄色葡萄球菌是引起各种感染的重要病原菌之一，可引起全身不同部位的感染。抗菌药物的不合理应用使MRSA的比例逐年增加且。MRSA所引起的感染成为临床较棘手的问题。本试验显示，291株金黄色葡萄球菌中MRSA检出131株，占45.02％ ，检出比例高于笔者先前报道[5]，分析原因可能是，有待于加强细菌耐药性监测，指导临床合理使用抗生素，和加强医院感染管理(如加强病房空气监测，监督医护人员勤洗手等)。
葡萄球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要有主动泵出和核糖体靶位改变2种 (核糖体靶位改变又包括结构变异和可诱导变异)。泵出型耐药基于基因编码外排蛋白所致，通常表现为红霉素耐药、克林霉素敏感。核糖体靶位改变由erm基因调控，erm基因介导的结构改变导致耐药：通常表现为对红霉素和克林霉素同时耐药；erm基因介导的诱导型耐药：通常表现为红霉素耐药、克林霉素敏感，但通过大环内酯类药物(如红霉素)诱导后则表现为克林霉素耐药[6]。本研究结果表明131株MRSA中 ，红霉素和克林霉素均敏感为24.43％，红霉素和克林霉素均耐药(erm基因介导结构型耐药)为58.02％，erm基因介导诱导型耐药为12.98％ ，msrA基因编码泵出型耐药为4.57％。160株MSSA中，红霉素和克林霉素均敏感为21.88％，红霉素和克林霉素均耐药(erm基因介导结构型耐药)为46.05％，erm基因介导诱导型耐药为38.75％，msrA基因编码泵出型耐药为3.12％。以上结果表明：金黄色葡萄球菌erm基因介导结构型耐药 (对红霉素和克林霉素耐药)的比例，MRSA高于MSSA；金黄色葡萄球菌erm基因介导诱导型耐药（红霉素耐药而克林霉素诱导耐药）的比例MSSA高于MRSA,但二
者的诱导率均高于陈文昭等的研究报道, 这可能与不同地区金黄色葡萄球菌红霉素耐药基因流行情况不同以及大环内酯类药物使用情况不同所造成。
VITEK2和双纸片法两种方法检测能力无差别（经χ2检验， P>0.05,无显著性差异）。以D试验为“金标准”， VITEK2检测克林霉素诱导酶的敏感性=98.73%、特异性=100%、准确性=99.66%、阳性预测值=100%、阴性预测值=99.53%。均可在临床使用。D试验简单易行，准确度高，可同时检测克林霉素和红霉素的耐药和诱导作用，可以各级医院使用，而VITEK不仅实现了自动化，而且用于大规模标本的筛查，但是仪器和试剂成本较高，适用于规模较大医院使用。
本次研究显示，我院MRSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为73.91% ，而MSSA中红霉素耐药克林霉素敏感株，诱导率为为77.27%，金黄色葡萄球菌红霉素诱导克林霉素耐药问题严重，建议临床医生在证实不存在红霉素诱导克林霉素耐药问题之前，不选择克林霉素作对抗由金黄色葡萄球菌引起感染的治疗。临床微生物实验室应常规进行诱导试验以保证克林霉素耐药检出的准确性，帮助临床合理有效及时的使用正确的抗菌药物。 参考文献：
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