微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸含量

食品安全质量检测学报 Journal of Food Safety and Quality

Vol. 10No. 5

Mar. , 2019

微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸含量

顾晨荣*, 徐 琼, 庞贝妮, 王志伟, 曲勤凤

(上海市质量监督检验技术研究院/国家食品质量监督检验中心, 上海 200233)

摘 要: 目的 建立微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸含量的分析方法。方法 通过比较不同浓度标准曲线对同一标准物质样品的测定结果, 确定准确最优的线性浓度范围, 并在该标准范围内进行重复性及加标回收实验。结果 当烟酸标曲线性浓度范围为5.0~50.0 ng时, 线性关系良好(r2=0.996)。该方法的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为1.71%(n=6), 平均回收率为94.4%。结论 该方法稳定准确, 适合用于测定婴幼儿乳粉中烟酸的含量。

关键词: 烟酸; 微生物法; 婴幼儿乳粉

Determination of niacin in infant milk powder by microbiological method

GU Chen-Rong*, XU Qiong, PANG Bei-Ni, WANG Zhi-Wei, QU Qin-Feng

(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China)

ABSTRACT: Objective To establish a method for the determination of niacin in infant milk powder by microbiological method. Methods By comparing the measurement results of the same standard substance sample with different concentration standard curves, the accurate and optimal linear concentration range was determined, and the repeatability and spike recovery test were carried out within the standard range. Results When the nicotinic acid standard concentration range was 5.0-50.0 ng, the linear relationship was good (r2=0.996). The relative standard deviation (RSD) of the method was 1.71% (n=6), and the average recovery was 94.4%. Conclusion The method is stable and accurate, which is suitable for determining the content of niacin in infant milk powder.

KEY WORDS: niacin; microbiological method; infant milk powder

目前我国现行的食品烟酸的检测标准为GB

5009.89-2016[8], 其中规定了2种检测方法, 第一法为微生物法; 第二法为高效液相色谱法。微生物法检测奶粉中的水溶性维生素是美国公职分析化学家协会AOAC要求的官方检测方法, 具有高灵敏度的特点, 对于含量低, 且低于仪器检出限的维生素目前仍然需要微生物法进行测定[9]。使用微生物法测定烟酸优势在于可测定出各类食品中为人体和动物机体可吸收利用的的烟酸总量(烟酸和烟酰胺)[10,11], 同时有成本投入较低、比较容易开展的优

1 引 言

烟酸(nicotinic acid), 又名尼克酸、维生素B3, 可分为烟酸和烟酰胺, 它们有同样的生理功能, 烟酸在人体内转化为烟酰胺, 烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分, 与人体的糖酵解、脂肪代谢、组织呼吸等人体生物代谢具有密切关系, 并在维持皮肤和消化器官正常功能中起着重要作用

[1-4]

, 同时其具有预防糙皮病、促进细胞新陈代谢、扩张血

管、降低人体胆固醇水平和防止心脏病的功效[5-7]。

基金项目: 上海市食品质量安全检测与评价专业技术服务平台(18DZ2292400)

Fund: Supported by Professional and Technical Service Platform for Detection and evaluation of Food Quality and Safety In Shanghai (18DZ2292400) *通讯作者: 顾晨荣, 硕士, 主要研究方向为食品微生物学。E-mail: gu9131@163.com

*Corresponding author: GU Chen-Rong, Master, Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China.

E-mail: gu9131@163.com

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食品安全质量检测学报 第10卷

点, 但存在检测步骤繁琐、检测周期长、实验易发生污染等缺点。而高效液相色谱法是测定强化食品中烟酸和烟酰胺, 其优势在于测定操作简便、分析速度快、分离效果好, 但也存在分析成本高, 液相色谱仪价格及日常维护费用贵的问题。

烟酸与蛋白质的代谢及婴幼儿的智力发育有密切关系, 对婴幼儿成长发育起着重要的作用[12], 因此婴幼儿乳粉都含有烟酸。对于婴幼儿而言, 维生素摄入不足或过量都有可能影响其健康, 所以婴幼儿乳粉中维生素含量国家有明确规定, 0~6月龄婴幼儿乳粉烟酸含量应为70~ 360 μg/100 kJ, 6~36月龄婴幼儿乳粉烟酸含量应不低于 110 μg/100 kJ

[13-15]

。微生物法测定烟酸具有灵敏度高、特

异性强且能够反映微生物的有效含量的特点, 但是在国标GB 5009.89-2016[8]

的实际应用过程中发现当烟酸标准浓度范围为50.0~500.0 ng, 结果与样品真值存在一定的偏差。本研究采用微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸的含量, 利用植物乳杆菌(ATCC 8014)对烟酸具有高灵敏度的特点, 通过其生长情况测定婴幼儿乳粉中烟酸的含量。本研究在GB 5009.89-2016[8]的基础上, 对标准品范围进行调整, 优化了微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸含量的方法, 以期为婴幼儿乳粉的安全监管提供更准确、稳定的方法。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 标准菌株

植物乳杆菌, ATCC 8014(中国微生物保藏中心)。 2.1.2 培养基

乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基、烟酸测定用培养基(美国BD公司); 实验用水为三级纯水。 2.1.3 仪 器

Centrifuge 5430离心机(德国EPPENDORF公司); UV-1800分光光度计(日本岛津公司); MS304S /01万分之一天平、FiveEasy pH计(美国METTLER TOLEDO公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 国标方法实验

1) 标准溶液的配制

精确称取50.0 mg烟酸标准品, 用25%乙醇溶液溶解并定容至500 mL制成储备液, 其烟酸浓度为100 μg/mL; 再从储备液中吸取1 mL, 用25%乙醇溶液定容至100 mL制成中间液, 其烟酸浓度为1 μg/mL; 再吸取5 mL中间液, 用水定容至50 mL制成工作液, 其烟酸浓度为100 ng/ mL。标准曲线管制备同GB 5009.89-2016[8]操作。

2) 样品测试液的制备

使用一定含量的标准溶液加入不含有烟酸成分的基粉中作为测试样品, 使其烟酸含量为5.0 mg/100 g。

精确称取3 g样品于烧杯中, 加入1%硫酸溶液30 mL,

于121 ℃水解30 min, 迅速冷却后用0.1%氢氧化钠溶液及0.1%盐酸溶液调节pH至4.5±0.1之间, 定量转移至 250 mL容量瓶中, 用水定容, 充分混合后, 用滤纸过滤后吸取10 mL滤液, 转移至100 mL容量瓶中, 用水定容。样品培养管制备同GB 5009.89-2016操作。

3) 接种菌悬液的制备

将保存的植物乳杆菌转接到乳酸杆菌琼脂培养基上, 于36 ℃培养18~24 h, 再将活化后的植物乳杆菌转接至乳酸杆菌肉汤培养基中, 于36 ℃培养18~24 h。将乳酸杆菌肉汤培养液以4500 r/min转速离心5 min, 弃上清后加入

10 mL无菌生理盐水充分混匀后再离心, 重复清洗3次。清洗完成后, 以生理盐水为空白, 于550 nm波长下测定接种菌悬液的透光率, 使其透光率在60%~80%之间。

4) 接菌培养

将培养管进行灭菌处理, 取出培养管后迅速冷却, 向培养管中加入30 μL接种菌悬液(除标准曲线1号管外), 将培养管置于36 ℃培养箱中培养18~24 h。

2.2.2 不同浓度标线测试实验

将100 ng/mL的标准溶液稀释成10、20、40 ng/ mL标准溶液, 其余操作同2.2.1操作。确定精确性最优的标线范围。

2.2.3 重复性及加标回收实验

精确称取同一批次婴儿配方乳粉6份进行重复性实验; 精确称取上述重复性实验用婴儿配方乳粉6份, 加入1 mL标准溶液(浓度为5.5 mg/100 mL), 进行加标回收实验。

2.2.4 吸光度测定与计算

在550 nm下, 以标准曲线培养管2号管为空白, 调节吸光度为0, 依次读出其他每支管的吸光度(A值)。以烟酸标准品含量为横坐标, 吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

3 结果与分析

3.1 国标方法实验结果

接菌标液吸光度测定与计算在550 nm下, 以标准曲线培养管2号管为空白, 调节吸光度为0, 依次读出其他每支管的吸光度(A值)。以烟酸标准品含量为横坐标, 吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。按GB5009.89-2016方法进行结果计算。

图1表明烟酸含量为50.0~500.0 ng时, 标准曲线的线性关系一般, 同时验证实验数据准确性, 采用烟酸试剂盒法进行实验, 结果见表1。通过烟酸试剂盒的结果可以判断标准样品中烟酸添加量合适, 微生物法计算值高于预期值。导致该现象发生的原因可能是由于标线最后几点含量较高的而其吸光度值比较接近, 导致样品的3、4号管计算所得值偏高, 从而导致样品结果偏高。因此将整体标线浓度进行下调进行测试。

第5期

顾晨荣, 等: 微生物法测定婴幼儿乳粉中烟酸含量

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图1 烟酸标准曲线图 Fig.1 Niacin standard curve

表1 精确性实验结果 Table 1 Accuracy test result

序号 烟酸含量/(mg/100 g)

烟酸含量/(mg/100 g)

国标法

试剂盒法

1 6.45 5.21 2 5.79 4.99 3 6.14 5.17 4 6.37 4.87 5 5.88 5.15 6 6.45 5.22 平均值 6.18 5.10 RSD/%

4.72

2.82

3.2 稀释后烟酸标准曲线制作与分析

当烟酸含量范围为5.0~50.0 ng时, 由图2可见其线性关系优于国标方法。由表2结果可以发现, 烟酸含量结果随标准曲线浓度范围的下降而下降。当烟酸含量范围为5.0~50.0 ng时, 结果更接近样品理论添加量值。因此使用5.0~50.0 ng标准溶液进行后续实验。

图2 10 ng/mL烟酸标准溶液标准曲线图

Fig.2 Standard curve of 10 ng/mL niacin standard solution

表2 精确性实验结果 Table 2 Accuracy test result 标曲范围5~50 ng

标曲范围标曲范围序号

烟酸含量10~100 ng 20~200 /(mg/100g)

烟酸含量烟酸含量/(mg/100g) /(mg/100g)1 5.03 5.51 6.01 2

5.10 5.46 6.12 3 4.84 5.33 5.78 4 4.87 5.28 5.69 5 5.02 5.61 5.94 6 4.91 5.34 5.82 平均值4.96 5.42 5.89 RSD/%

2.07

2.33

2.70

3.3 重复性与加标回收实验结果

由表3结果可见, 重复性实验结果较稳定, 样品烟酸含量测定平均值为6.03 mg/100 g, 相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为1.71%。该方法加标回收率结果良好, 样品平均回收率为94.4%(表4)。

表3 重复性实验结果

Table 3 Repeatability test results 序号 烟酸含/(mg/100g)

1 5.93 2 6.14 3 6.04 4 6.15 5 6.02 6 5.90 平均值 6.03 RSD/%

1.71

表4 加标回收实验结果

Table 4 Addition standard recovery test results 理论烟酸 实测烟酸 序号含量值 含量值 回收率 平均 /(mg/100 g)

/(mg/100 g)

/% 回收率/%

1 7.64 88.0 2 7.81 97.3 3 7.93 103.8 4

7.86 7.87 100.5 94.4 5 7.60 85.8 6

7.69

90.7

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食品安全质量检测学报

第10卷

4 结 论

本研究采用微生物法对婴幼儿乳粉中的烟酸含量进行测定, 在使用BD烟酸测定培养基的情况下, 所测得的标准曲线在5.0~50.0 ng范围内的线性关系良好, 所测样品RSD为1.71%(n=6), 加标回收实验平均回收率为94.4%。表明该方法重现性较好, 稳定性较好, 适用于婴幼儿乳粉中烟酸含量的测定。 参考文献

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(责任编辑: 陈雨薇)

作者简介

顾晨荣, 硕士, 主要研究方向为食品微生物学。

E-mail: gu9131@163.com