姓名：何家俊（5131509025）实验日期：2016年5月9日
实验五PCR检测食源性细菌
一.实验目的
（1）了解PCR的原理
（2）掌握PCR检测的具体操作
二.实验原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解旋，当温度降低后可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计好的引物，DNA聚合酶、dNTP和含有目的基因的DNA片段就可以完成特定基因的体外复制。
上海交通大学食品安全与微生物实验室通过构建食源性细菌特异性靶点发掘平台SMM-system，筛选出来副溶血性弧菌的特异性基因irgB。本实验就是用irgB基因对分离出来的副溶血性弧菌疑似菌株进行鉴定。irgB引物的基本信息如下：
引物irgB的序列
引物名称 引物序列 片段大小/bp
L-irgB:5’-CGATACACACCACGATCCAG-3’
IrgB 369
R-irgB:5’-ATACGGCCGGGGTGATGTTTCT-3’
三.仪器、试剂与材料
（1）试剂：10×PCR buffer、MgCl2、dNTP、引物irgB（10μM）、TaqDNA聚合酶（1.0U/μL）、副溶血性弧菌模板DNA、ddH2O。
（2）仪器设备：Eppendorf核酸扩增仪、RAD300电泳仪及电泳成套设备、GIS2020凝胶成像系统、离心机、微量移液器。
四.实验步骤
（1）PCR反应：根据文献报道，最终得到较为稳定的反应体系和反应条件。PCR反应体系如下
Mix 12.5μL ddH2O 9.5μL F 1μL R 1μL Template 1μL Total 25μL
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2013级《食品微生物实验》报告
姓名：何家俊（5131509025）实验日期：2016年5月9日
PCR的反应条件：
过程 温度/℃ 时间
94 5min 预变性
94 30sec 变性
62 30sec 退火 30-35次循环 72 30sec 延伸
72 10min 延伸
12 保存
PCR结束后，按照PCR仪面板提示进行操作，退出PCR反应程序后，关闭电源。
（2）琼脂糖凝胶电泳 PCR程序结束之后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察实验结果：取5μLPCR产物使之与1μL10×Loading buffer充分混合，然后点再1.5%的琼脂糖凝胶上样孔中，在120V电压下电泳25min。 （3）紫外凝胶成像 电泳结束后取出凝胶，在EB染色剂中染色10-15min后，在紫外成像系统中观察实验结果并得到相应的琼脂凝胶电泳图。
五.结果与讨论
值得一提的是，本次实验的凝胶是助教提前配制好的，所以我们就直接自己加样了。而电泳的结果如下图所示：其中，用红色框框框住的为本人电泳结果，仪器拍出来的照片太黑，比较难看清。依稀可见的仅有一条条带，相比于其他组黑黑的一片，实验结果已经算是不错了。说明实验还是较为成功的，这不仅与这一次的操作有关，还跟上次实验得出的DNA样品质量较好有很大的关系。
六. 注意事项
（1）EB（溴化乙锭）具有强致癌性，使用时应佩戴手套，并避免污染干净的仪
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2013级《食品微生物实验》报告
姓名：何家俊（5131509025）实验日期：2016年5月9日
器和工作台；
（2）尽量减少TaqE在室温中的暴露时间；
（3）PCR反应结束后，应尽早将PCR产物取出（避免机器模块出现冷凝水）。 （4）加样品时为防止手抖，可以用另一只手稍微扶一下，提高准确度。
七．实验收获
本次实验是用PCR技术检测食源性细菌，PCR技术对我们来说已经不再陌生，原理在课上老师也已经跟我们说过很多次了，实验过后能进一步的加深我们对于PCR技术的理解。由于用到了上次实验提取出来的DNA，所以本次实验的成败除了跟这一次的操作正确与否有关外，还取决于上次实验提取出来的DNA的质量。实验过程中比较麻烦的一点就是，反应体系所需要的试剂量非常小，最低仅需1μL，这时候用移液枪添加试剂误差是非常大的，于是自然而然的想到了一些解决的方法，记得大一下学期的时候本人就跟着生科院的老师做PRP项目，里面的解决办法就是多做几个样品，将体系加完以后混合起来，在加样品的时候再取适量体积，这样就能减少偶然误差等。实验过后还是对PCR的操作，电泳的操作有了更进一步的了解，收获还是相当大的。最后，十分感谢老师的耐心指导和队友们的全力配合。
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