正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究

正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其

异构体比例研究

作者：徐菁, 王宏伟, 李晓红, 朱镭,张丽,张帆,覃艳红,杨涛

【摘要】 本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系。 采用实时荧光定量RT

PCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD15+CD11b+、CD33+CD14+、CD20+CD5-和CD20-CD5+细胞群中总WT1、WT1(＋17AA)及WT1(+KTS)的表达。结果表明： 与K562细胞相比，CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD15+CD11b+和CD33+CD14+ 细胞群中均存在WT1基因的低表达，且依次逐渐降低；在 CD20+CD5-和CD20-CD5+ 细胞群中未检测到WT1基因表达。在分化程度较低的CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞群中以+17AA，+KTS及WT1（+/+）异构体为主，而较成熟的CD15+CD11b+和CD33+CD14+细胞群中以

17AA、

KTS及WT1

（/）异构体为主。结论： 在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低，造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。

【关键词】 骨髓 WT1基因 WT1基因异构体 基因表达

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WT1 Gene Expression and Its Isoform Ratio in Different Cell Subsets of Normal Human Bone Marrow

Abstract The Wilms' tumor gene (WT1) is a transcription factor involved in tumorigenesis, especially in leukemogenesis. However, the role of WT1 expression in nonmalignant hematopoietic cells remains unclear. Furthermore, due to alternative splicing at two sites: 17 amino acid residues of exon 5 (+17AA) and 3 amino acid residues (+KTS) between exons 9 and 10, WT1 gene has four main isoforms (17AA+/KTS+, 17AA+/KTS17AA

/KTS+, 17AA

/KTS

, abbreviation: +/+，+/，/+，

, /

) . The isoforms probably existed in hematopoietic cells, which make the research more complex. The aim of study was to elucidate the expression and its isoforms of WT1 gene in different cell subsets of healthy bone marrow donors. The fluorescence RTestablished to measure the expressions of fulland WT1(+KTS) in CD34+CD38cell),

CD15+CD11b+

PCR detection system was length WT1, WT1(+17AA)

(stem cell) , CD34+CD38+(progenitor

CD33+CD14+(monocyte),

lymphocyte )

(granulocyte),

CD20+CD5- (Blymphocyte) and CD20-CD5+ (T

subsets from 18 normal human bone marrow samples. The results showed that WT1 expressed in CD34+CD38-, CD34+CD38+, CD15+CD11b+ and CD33+CD14+, but not in CD20+CD5- and CD20-CD5+ subsets. The highest expression was in CD34+CD38-, but decreased gradually in

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CD15+CD11b+ and CD33+CD14+ subsets. WT1(+17AA), WT1(+KTS) and WT1（+/+）isoforms were predominant in CD34+CD38- and CD34+CD38+ primitive subsets, while in CD15+CD11b+ and CD33+CD14+ the dominant isoforms were WT1(

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17AA), WT1(KTS) and WT1（/）. It is concluded that the

expression of WT1 in normal bone marrow decreases gradually with cell differentiation. Hematopoietic cells may adjust the ratios of WT1 isoforms to inhibit or promote cell differentiation.

Key words bone marrow; WT1 gene; WT1 gene isoform; gene expression

WT1基因（Wilms瘤基因）作为一种重要的转录调控因子参与许多肿瘤特别是白血病的发生。WT1 mRNA经过选择性剪接可以编码4种同源异构体［1］。在第5外显子处，编码17个氨基酸插入调控区与锌指区之间，可把WT1表达蛋白分为+17AA及

17AA两种异构体。

ThrKTS

在第9外显子末端即第3和第4锌指结构之间插入KTS（LysSer） 3个氨基酸，从而又可将WT1表达蛋白分为+KTS和

两种异构体。通过不同的组合，可细分为4种主要的剪接体。这4种不同的含锌指结构的DNA结合蛋白分别为 +17AA/+KTS 、 +17AA/

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KTS、

(+/+、+/、

17AA/+KTS和 /+和

/

17AA/KTS， 以下分别简称为

)。许多研究表明，4种异构体在转录、剪接

和调控细胞基本功能如增殖，分化及凋亡方面各不相同［2］。

中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究早期研究表明，WT1只在正常骨髓CD34+细胞中表达，而在分化成熟细胞中不表达。 Ellisen等［3］证实，正常造血细胞分化成熟过程中WT1会出现第2次高表达,那么真实情况如何，特别是细胞分化成熟的不同阶段4种异构体的表达比例如何，目前尚不清楚。本研究采用特异性好、灵敏度高的实时荧光定量RT

PCR技术，同时借助流式细胞分选手段对正常造血

过程中WT1基因的表达程度及其不同异构体构成比例进行系统地研究，旨在为进一步探讨WT1在白血病发生机制中的作用奠定基础。 材料和方法

研究对象

18份健康供者骨髓标本，以WT1表达的白血病细胞系K562作为阳性对照。

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主要试剂

荧光抗体FITC

CD34、CD15、CD33、CD20、IgG, PE

CD38、

CD11b、CD14、CD5、IgG，Pc5to

CD45均购自PharMingen公司。 Cells

cDNATMII购自美国Ambion公司，引物及探针由上海基康公

司合成，荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司。

抗体标记方法

取抗凝骨髓2-5 ml,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，计数（5-10）×106细胞，分别标记CD34/CD38/CD45、CD15/CD11b/CD45、CD33/CD14/CD45、CD20/CD5/CD45，每种抗体各20 μl，暗室孵育30分钟；另外,CD15/CD11b/CD45抗体标记采用新鲜抗凝骨髓30 μl，每种抗体分别加5 μl，加1×PBS 30 μl，暗室孵育30分钟后裂解红细胞。所有标记细胞置于冰上直至分选。

细胞的流式细胞仪分选

用Beckman Coulter EPICS Elite分选型流式细胞仪,根据仪器手册设置好各项参数,安装分选器,使用标准荧光微球(CoulterImmunotech公司产品)调试最佳Delaytime和Drive值。初始设门采用侧向角（side scatter, SSC）散射和CD45设门，进行细胞分群。 选定

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原始细胞群，第2设门将初始设门中的原始细胞引入CD34/CD38门，分选CD34+CD38+（干细胞）/ CD34+CD38-（祖细胞）；同理，选定单核细胞群，分选CD33+CD14+（单核细胞）；选定淋巴细胞群，分选CD20+CD5-（B淋巴细胞），CD20-CD5+（T淋巴细胞）；选定粒细胞群，分选CD15+CD11b+（粒细胞），分别分选1 000个细胞进行检测。

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RNA的提取和cDNA的合成

依据Cells

荧光定量RT

引物及探针自行设计，由上海基康公司进行合成，序列如下:

总WT1探针：5'向引物：5'

FAMCGGAGCCCAATACA

MGB

3'， 正

PCR检测 to

cDNATMII试剂说明书进行。

GATAACCACACAACGCCCATC

3' ；

3'， 反向引物：5'

CACGTCGCACATCCTGAATG

+17AA探针：5'3'； 正向引物：5'物：5'

GGATGG

FAMCAGCACAGGGATCGA

GCAGAGCA3'；

GAMGB3'， 反向引

TGGACAGAAGGGCGTTGTGTGGT

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+KTS探针：5'物：5'5'

FAMTTCCGGTCCGACCAMGB

3'， 正向引

CAAAAGACACCAAAGGAGACATACA

TCACTTGTTTTAC

3'， 反向引物：

CTGAAGGGCTTT β

actin探针：5'

3'；

FAMATCATTGCTCCTCCTGAGMGB3'，

正向引物：5'物：5'

GCTCAAAAGACACCAAAGGAGAC

AGGGCTTTTCACTTGTTT

3'， 反向引

AGCTGA3'。

反应体系25 μl： 包括TaqMan Core Regeants 12.5 μl,10 μmol/L引物各2.25 μl,10 μmol/L探针0.625 μl，cDNA 2 μl，补水至25 μl。反应条件：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟；95℃ 30秒，60 ℃ 30秒，45个循环。反应设立内对照β+17AA/β

actin、 +KTS/β

actin。将WT1/β

actin、

actin分别作为WT1基因及+17AA、

+KTS异构体的相对表达量 ［4］。

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