维普资讯 http://www.cqvip.com 国际检验医学杂志２００８年３月第２９卷第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３ ・ ２０９・ ・论著・ 改良血清单胺氧化酶测定法及临床应用 唐先平 秦媛媛杨晓兰 伍四春侯卫红 【摘要】 目的 建立一种新的血清单胺氧化酶（ＭＡＯ）测定法，以提高检测ＭＡＯ活力的特异性 和准确性。方法 用３一甲基Ｎ一乙基（８一羟乙基）苯胺（ＭＥＨＡ）为色原系统进行患者血清ＭＡＯ活力 测定。结果对缓冲液最适浓度、ｐＨ和种类的选择非常重要，可提高灵敏度，线性范围为０～２５０ ｕ／ｉ ，正常值范围为３０ Ｕ／Ｌ内，回收率为９２．４ ～１０２．６ ，精密度：批内ＣＶ＝２．５ ～４．０％，批问 ＣＶ＝３．３ ～４．５ 。与二硝基苯肼比色法比较，相关性良好（ｒ一０．９８６）。结论 本法具有高度的特 异性和准确性，操作简便，灵敏快速，标本用量少，结果稳定，对肝硬化的诊断有非常重要的作用。 【关键词】单胺氧化酶； 方法； 临床实验室技术 中图分类号：Ｒ４４６．１１２；Ｒ５７５．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２００８）０３—２０９ ０２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｏｒｍｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｓｓａｙ ＴＡＮＧ Ｘｉａｎ—ｐｉｎｇ，ＱＩＮ Ｙｕａｎ ｙｕａｎ， ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌａｎ，ｅｔ ａ１．ｔｈｅ ２７３ｒｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＰＬＡ，Ｋｕｒｌｅ ８４１０００，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＭＡＯ）ｄｅｔｅｒｍｉ— ｎａｔｉｏｎ，ＳＯ ａｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ＭＡＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｅｒｕｍ ＭＡＯ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ３－ｍｅｔｈｙ Ｎ—ｅｔｈｙｌ（ ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ１）ａｎｉｌｉｎｅ（ＭＥＨＡ）ａｓ ｐｉｇｍｅｎｔ ｓｙｓ— ｔｅｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｔ ｗａｓ ｖｉｔａｌ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｓｏｒｔｓ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒｓ．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂ— ｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ：Ｏ－２５０ Ｕ／Ｉ ；ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒａｎｇｅ：＜３０ Ｕ／Ｌ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：９２．４ 一１０２．６ ；ｅｘａｃｔｉ ｔｕｄｅ：ｗｉｔｈｉｎ－ｒｕｎ ＣＶ＝２．５ 一４．０ ；ｂｅｔｗｅｅｎ－ｒｕｎ ＣＶ＝３．３ 一４．５ ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａ— ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｎｉｔｒｏ—ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｍｅｔｒｙ（ｒ一０．９８６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉａｌｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ，ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｒａｐｉｄｉｔｙ，ｌｅｓｓ ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｅ ｓ ｕｌｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ； Ｍｅｔｈｏｄｓ； Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 单胺氧化酶（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＭＡＯ）全名为 红色醌类物质，其颜色的深浅与ＭＡＯ的活性成正 单胺氧化还原酶，其在大脑和周围神经组织中催化一 比，从而计算出ＭＡｏ的活性单位。 些生物体产生的胺，氧化脱胺产生过氧化氢 ２．试剂：（１）０．０５ ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）。 （Ｈ Ｏ ）口 。生化研究结果表明，人体血清中ＭＡｏ的 （２）反应终止液：０．０１ ｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠溶液。 性质与结缔组织中的ＭＡｏ相似，了解血清ＭＡ０的 （３）底物反应液：用０．０５ Ｍ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）配 活性可问接反映结缔组织的增生情况，可作为肝硬化 制，每升反应液中含抗坏血酸氧化酶４ ｋＵ、过氧化物 的辅助诊断方法，由此引起了极大的重视。本研究经 酶２ ｋＵ（中国科学院上海生物化学研究所提供）、脂蛋 过实验建立一种新的操作简便、特异性高、灵敏准确 白脂酶２ ｋＵ、丙烯酰胺３０ ｍＭ、曲拉通Ｘ一１００ ０．５ 的全酶血清ＭＡｏ测定法，现报道如下。 ｍＬ。（４）显色液：用０．０５ Ｍ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４） 配制，每升显色液中含ＭＥＨＡ（上海丰汇医学科技有 材料与方法 限公司赠）６０ Ｍ和曲拉通Ｘ一１００ ０．５ ｍＩ 。（５）标准 １．测定原理：底物丙烯酰胺在适宜的条件下，经 液：用定值的羊血清ＭＡｏ配制。 血清ＭＡＯ作用生成Ｈ Ｏｚ，ＨｚＯｚ与３一甲基一Ｎ一乙基 ３．测定方法：（１）操作步骤：０．０５ ｍＬ血清样品加 （Ｇ一羟乙基）苯胺［３一ｍｅｔｈｙｌ—Ｎ～ｅｔｈｙｌ（ —ｈｙｄｒｏｘｙ ｅｔｈｙ１） 入１．Ｏ０ ｍＩ 底物反应液，放入３７℃水浴箱保温 ｂｅｎｚｅｎｅ ａｎｉｌｉｎｅ，ＭＥＨＡ３在过氧化物酶的作用下生成 ５ ｍｉｎ，再加入１．（）（］ｍＬ显色液混匀后，放入３７℃水 浴箱保温３０ ｍｉｎ，最后加入反应终止液０．０５ ｍＬ混 作者单位；８４１０００库尔勒，解放军第二七三医院（唐先平、秦媛嫒、 匀，取出在７２２型分光光度计上，用５６０ ｎｍ波长、１ 杨晓兰、伍四春）；８４１０００新疆维吾尔自治区库尔勒市第二人民医院 ｃｍ光径杯，以空白调零点比色测其吸光度，空白管及 （侯卫红） 标准管分别用水及ＭＡＯ标准液代替血清样品进行 维普资讯 http://www.cqvip.com
国际检验医学杂志２００８年３月第２９卷第３期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．３ 操作。（２）计算：ＭＡＯ活力（ｕ／Ｉ ）一Ａ测定×ＭＡＯ标 肝硬化患者中的阳性率（８０ ～８８ ，ｏ４）高。 ２．急性肝炎患者６２例：５９例患者血清ＭＡＯ活 准液的值／Ａ标准。 结 果 力正常，为１５～２９ ｕ／ｉ ；２例患者血清ＭＡＯ活力分 别为３８、４４ Ｕ／Ｌ；另１例患者为急性坏死性肝炎，对 １．缓冲液最适浓度、ｐＨ及种类的选择：经试验测 定选用０．０５ Ｍ、ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液。 ２．最大吸收峰测定：选择４００～６００ ｎｍ波长测 其进行血清ＭＡＯ动态测定观察，结果分别为３８、４６、 ５８、６９、８３ Ｕ／Ｌ，死亡时此酶达到１０９ Ｕ／Ｌ，呈进行性 增高。所以急性肝炎患者如血清ＭＡＯ明显增高，应 提示有肝细胞坏死病变发生。 ３．慢性肝炎患者５８例：５６例患者血清ＭＡＯ活 定，本法显色液的最大吸收峰为５６０ ｎｍ。 ３．显色液稳定性观察：显色后将显色液室温放 置，其吸光度在３０ ｍｉｎ内几乎无变化，４５ ｍｉｎ后吸光 力正常，为１２～２９ ｕ／ｉ ；２例患者有不同程度的增高， 度呈缓慢下降趋势。 ４．精密度测定：本法批内（ 一１０）ＣＶ＝２．５ ～ ４．０ ，批间（ ＝１５）ＣＶ＝３．３％～４．５ ，说明精密度 良好。 ５．回收试验：取１份已知酶活力单位的肝硬化患 者血清，加入羊血清ＭＡｏ标准品，测定其ＭＡｏ的活 力，其回收率为９２．４ ～１０２．６ ，平均回收率为 ９６．６ 。 ６．线性范围测定：取羊血清ＭＡｏ标准品配制成 Ｏ～３００ Ｕ／Ｌ的不同浓度进行ＭＡＯ活力测定，其 ＭＡＯ活力在Ｏ～２５０ Ｕ／Ｌ呈良好的线性关系。 ７．方法学比较：用本法与二硝基苯肼比色法＿２ 同 时对５Ｏ份血清标本进行ＭＡＯ活力测定，其相关系数 为ｒ一０．９８６，回归方程ｙ一０．１ｌ２Ｘ一０．１，两法呈高度 相关。 ８．正常参考值测定：用本法测定２４０例３～７ｏ岁 经体检无异常、无肝脏、心脏及肺部疾病的健康人群。 按年龄大小分为４组进行检测，其结果表明ＭＡＯ含 量与年龄成反比。正常参考值儿童组＜６ｏ Ｕ／Ｌ、少年 组＜４Ｏ Ｕ／Ｌ、成人组％３０ Ｕ／Ｌ。 临床应用 应用本法对２５３例成人住院患者进行空腹抽血 测定血清ＭＡＯ含量。 １．肝硬化患者５Ｏ例：其中１例经病理检查诊断 为肝癌，４例为肝硬化脾切除后患者。５Ｏ例中４５例 血清ＭＡＯ活性不同程度增高（３５～１０９ Ｕ／Ｌ），平均 为５８ Ｕ／Ｌ，其增高率为９０ ，较文献报道的ＭＡＯ在 分别为３９、５８ ｕ／ｉ ，其中１例患者随着病情好转，由 活动期转为静止期时，血清ＭＡＯ活力也随之下降， 由原来的５８ Ｕ／Ｌ降至２８ Ｕ／Ｉ 。 讨 论 １．选择高灵敏度的色原系统是提高检测灵敏度的有 效途径。ＭＥＨＡ色原系统试剂无毒性，灵敏准确，显色 稳定性好，结果不受黄疸、溶血等物理性干扰。 ２．缓冲液的浓度、种类及ｐＨ的选择对本法起着 非常重要的作用。在底物反应液中加入抗坏血酸氧 化酶，以破坏维生素Ｃ，避免还原性物质对结果的影 响；加入曲拉通Ｘ一１００表面活性剂是防止显色液发生 浑浊，保证各种试剂的透明度。过氧化物酶和脂蛋白 酶的活力一定要掌握好，否则会影响实验结果。 ３．有文献报道认为血清ＭＡｏ极不稳定，强调 应在抽血后立即检测。本组观察到血清在冰箱保存 ５ ｄ，其ＭＡＯ活力几乎没有变化，说明ＭＡＯ在体 外相当稳定，在体内波动较小，与文献报道的完全 不同。血清ＭＡＯ对肝硬化的诊断阳性率大多为 ８Ｏ ～８８ ，由于ＭＡＯ并非诊断肝硬化的特异性 酶，但只要注意鉴别，仍是肝硬化辅助诊断很有价 值的指标。 参 考 文 献 ［１］Ｓｈｉｈ ｊｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＡＯ Ａ ａｎｄ Ｂ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏ— ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９１，４（１）：卜７． （收稿日期：２００７ ０７—０４）